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台灣龜殼花蛇毒絲胺酸水解酵素的生化特性分析及其基因選殖、表現

為了解決響尾蛇x6 pro的問題，作者洪金俊 這樣論述：

許多具纖維蛋白原 (fibrinogen) 分解活性的蛇毒絲胺酸蛋白酵素已從台灣龜殼花毒液中被純化出來，這些被純化出的酵素對於纖維蛋白原的 b 鏈及激汰原 (kininogen) 有高度的水解能力，進一步鑑定顯示它們的分子量介於 28,000-33,000之間，較高分子量的蛋白證實是屬於醣蛋白(glycoprotein)。受質測定顯示它們具有酯酵素 (esterase) 及醯胺酵素 (amidase) 的活性，尤其對一種微血管增滲酵素 (kallikrein) 的受質N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide有最好的作用。此類酵素相當穩定，

加熱至 80℃ 仍有活性。經 N-端氨基酸序列分析得知與另兩種具纖維蛋白原凝固與阻止血栓形成功用的蛇毒絲胺酸蛋白酵素batroxobin 及 ancrod 有極高的相似。進一步藉由免疫轉印染色看出台灣龜殼花絲胺酸蛋白酵素可和大部分響尾蛇科毒液有或多或少的交互作用。 用純化的絲胺酸蛋白酵素於試管內水解纖維蛋白原，可以延長纖維蛋白凝固的時間，接著進行老鼠尾部出血時間試驗，也發現隨著蛇毒蛋白濃度增加，止血的時間也延長。本實驗亦證實了龜殼花絲胺酸蛋白酵素可以使大白鼠的血壓降低，而batroxobin 及 ancrod 則無法有此功能。 為了得到其核酸序列，我們使

用聚合酵素鏈反應 ( ploymerase chain reaction) 選殖互補核酸 (cDNA)，經由核酸定序，至少得到五條以上的序列。從這些核酸序列編碼出的氨基酸序列看出，皆由257或 260 個氨基酸組成且在N-端之前皆含有一段24個氨基酸序列的signal peptide。 根據氨基酸序列比對及相似性排列，顯示它們和其他胺酸蛋白酵素家族一樣擁有組織胺酸 (His)，天門冬酸 (Asp)及絲胺酸 (Ser) 所組成的活化中心。為了得到大量單一的蛇毒蛋白，我們利用基因工程技術在大腸桿菌內表現蛇毒絲胺酸蛋白酵素，經過親合管柱及層析管柱分離，得到的表現蛋白活性可以和從粗毒純化出的蛋白酵素一

樣。 本實驗另一成果是我們設計了方便於表現蛋白純化的酵素水解位置，即根據血管增滲酵素的受質特性設計出含有 Phe-Leu-Arg 等類似位置的融合蛋白 (fusion protein)，在經過金屬親合管柱純化後，在其進行蛋白再折疊 (refolding) 時藉由互相的水解而將融合蛋白切除，以此種方法可以縮短純化時間而且也得到沒有融合蛋白的原態表現蛋白。